Clearing istantaneo del biofilm (iCBiofilm): un approccio ottico per rivisitare l'imaging di biofilm batterici e fungini

May 19, 2024

Biologia delle comunicazioni volume 6, numero articolo: 38 (2023) Citare questo articolo

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L’imaging dell’intero biofilm con risoluzione di singola cellula è necessario per l’analisi a livello di sistema dell’eterogeneità cellulare, l’identificazione delle funzioni chiave dei componenti della matrice e la risposta alle cellule immunitarie e agli antimicrobici. A tal fine, abbiamo sviluppato un metodo di schiarimento e imaging dell'intero biofilm, chiamato schiarimento istantaneo del biofilm (iCBiofilm). iCBiofilm è un metodo semplice, rapido ed efficiente che prevede l'immersione di campioni di biofilm in un mezzo di corrispondenza dell'indice di rifrazione, consentendo l'imaging istantaneo dell'intero biofilm con la microscopia confocale a scansione laser. Abbiamo inoltre sviluppato iCBiofilm non fissante, che consente l'imaging in tempo reale e dinamico dello sviluppo del biofilm e delle azioni degli antimicrobici. iCBiofilm è applicabile per l'imaging multicolore di proteine ​​fluorescenti, componenti della matrice immunocolorata e cellule marcate con fluorescenza in biofilm con uno spessore di diverse centinaia di micrometri. iCBiofilm è scalabile dai biofilm batterici a quelli fungini e può essere utilizzato per osservare le interazioni biofilm-neutrofili. iCBiofilm rappresenta quindi un importante progresso per esaminare le dinamiche e le funzioni dei biofilm e rivisitare la formazione di biofilm batterici e fungini.

I biofilm batterici sono comunità batteriche altamente organizzate formate su superfici abiotiche o biotiche e interfacce aria-liquido. I biofilm batterici sulle superfici degli impianti medici e dei tessuti corporei possono essere resistenti agli agenti antimicrobici e ai sistemi di difesa dell’ospite, inclusi fagociti, complementi e peptidi antimicrobici. Questo fenomeno causa varie malattie infettive umane croniche, come infezioni del torrente sanguigno correlate a cateteri, infezioni del tratto urinario ed endocardite1,2,3. La formazione di biofilm in ambito clinico, pertanto, determina un aumento della morbilità e della mortalità, imponendo un onere finanziario significativo al sistema sanitario. Inoltre, i biofilm possono causare problemi logistici nelle operazioni tecniche, come quelli incontrati nella manutenzione dei sistemi di distribuzione dell’acqua potabile4. Tuttavia, i biofilm possiedono anche caratteristiche benefiche per l’industria umana, come quelle sfruttate dalla produzione alimentare fermentata, dai processi di bioconversione per composti organici e dal trattamento delle acque reflue5. Lo sviluppo di strategie innovative per il controllo e l'analisi della formazione del biofilm è quindi significativo per diversi ambiti.

Si ritiene che le cellule batteriche nei biofilm siano racchiuse in una matrice tipicamente autoprodotta comprendente sostanze polimeriche extracellulari (EPS) come proteine, polisaccaridi e/o DNA extracellulare6. L'EPS svolge diversi ruoli nella formazione e nel mantenimento delle strutture del biofilm attraverso la stimolazione della coesione microbico e dell'adesione microbico-superficie6. Tuttavia, le distribuzioni tridimensionali dei componenti della matrice del biofilm e le proprietà eterogenee delle cellule batteriche incorporate non sono completamente comprese. Inoltre, l’eterogeneità o la differenziazione cellulare nei biofilm è un concetto comunemente accettato, ma nel caso dei biofilm spessi è stato difficile ottenere prove dirette su scala microscopica.

Lo sviluppo di strategie che consentano una visualizzazione rapida ed efficiente del biofilm è quindi necessario per comprendere meglio le loro strutture e funzioni, comprese le interazioni con altri microbi e con l’ospite e le risposte agli antimicrobici. Mentre la microscopia ottica (OM), come la microscopia confocale a scansione laser (CLSM) e la microscopia a foglio luminoso combinata con sonde a fluorescenza, ha consentito ai ricercatori di studiare l'architettura tridimensionale del biofilm e di dare un contributo sostanziale all'attuale comprensione dei biofilm7,8,9 ,10, l’imaging di biofilm spessi a livello di singola cellula rimane impegnativo, poiché la penetrazione della luce nelle regioni più profonde è limitata quando si utilizzano tecniche OM convenzionali. Inoltre, il CLSM standard che utilizza una lente ad immersione in acqua ha consentito l'imaging in tempo reale con risoluzione a singola cellula di un biofilm di Vibrio cholera11,12. Questo metodo può essere applicabile all'imaging di altri biofilm batterici.